綿羊Ⅱ型膠原（Col Ⅱ）酶聯(lián)免疫分析
試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用。
檢測范圍： 96T
0.3µg/L – 8.0µg/L
使用目的：
本試劑盒用于測定綿羊血清、血漿及相關(guān)液體樣本中Ⅱ型膠原（Col Ⅱ）含量。 實驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中綿羊Ⅱ型膠原（Col Ⅱ）水平。用純化的綿羊Ⅱ型 膠原（Col Ⅱ）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入Ⅱ型膠原（Col Ⅱ），再與 HRP 標記的Ⅱ型膠原（Col Ⅱ）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過 *洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化 成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Ⅱ型膠原（Col Ⅱ）呈正相關(guān)。用酶標儀在 450nm 波 長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中綿羊Ⅱ型膠原（Col Ⅱ）濃度。 試劑盒組成
| 1 | 30 倍濃縮洗滌液 | 20ml×1 瓶 | 7 | 終止液 | 6ml×1 瓶 |
| 2 | 酶標試劑 | 6ml×1 瓶 | 8 | 標準品（16µg/L） | 0.5ml×1 瓶 |
| 3 | 酶標包被板 | 12 孔×8 條 | 9 | 標準品稀釋液 | 1.5ml×1 瓶 |
| 4 | 樣品稀釋液 | 6ml×1 瓶 | 10 | 說明書 | 1 份 |
| 5 | 顯色劑 A 液 | 6ml×1 瓶 | 11 | 封板膜 | 2 張 |
| 6 | 顯色劑 B 液 | 6ml×1/瓶 | 12 | 密封袋 | 1 個 |
標本要求 綿羊Ⅱ型膠原酶聯(lián)免疫分析試劑盒
1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能 馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融
2．不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。 操作步驟
1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀 釋。
| 8.0µg/L | 5 號標準品 | 150µl 的原倍標準品加入 150µl 標準品稀釋液 |
| 4.0µg/L | 4 號標準品 | 150µl 的 5 號標準品加入 150µl 標準品稀釋液 |
| 2.0µg/L | 3 號標準品 | 150µl 的 4 號標準品加入 150µl 標準品稀釋液 |
| 1.0µg/L | 2 號標準品 | 150µl 的 3 號標準品加入 150µl 標準品稀釋液 |
| 0.5µg/L | 1 號標準品 | 150µl 的 2 號標準品加入 150µl 標準品稀釋液 |
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、
待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣 50µl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40µl，
然后再加待測樣品 10µl（樣品zui終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡 量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
4. 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此 重復 5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑 50µl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同 3。 綿羊Ⅱ型膠原酶聯(lián)免疫分析試劑盒
8. 洗滌：操作同 5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50µl，再加入顯色劑 B50µl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
15 分鐘.
10. 終止：每孔加終止液 50µl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應在加終止 液后 15 分鐘以內(nèi)進行。
計算
以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的 OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標 準曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，
即為樣品的實際濃度。 注意事項
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未 用完，板條應裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3．各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間 控制在 5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時做標準曲線，zui好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本 OD 值 大于標準品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計 算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存。 綿羊Ⅱ型膠原酶聯(lián)免疫分析試劑盒
7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9．本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。 保存條件及有效期
1．試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6 個月
