磷酸鈣法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞
實(shí)驗(yàn)材料 293T細(xì)胞
試劑、試劑盒 無菌水ddw NaCl KCl Na2HPO4 glucose HEPES CaCl2
儀器、耗材 Eppendorf管 培養(yǎng)皿 培養(yǎng)箱
一.試劑配制
無菌水ddw： 高溫滅菌； 分裝；
2XHBS： 280mM NaCl
10mM KCl
1.5 mM Na2HPO4
12 mM glucose
50 mM HEPES
Adjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 過濾滅菌，分裝；
2M CaCl2： 過濾滅菌，分裝。
二. 實(shí)驗(yàn)過程：
1. 鋪細(xì)胞： 選擇狀態(tài)良好的293T細(xì)胞傳代， 2-3x105個(gè)細(xì)胞/35mm dish。
2. 20-24h后，待細(xì)胞長至鋪滿瓶底約50-70%的時(shí)候，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。下面就35mm dish為例，采用以下轉(zhuǎn)染體系：
ddw： 105ul
plasmid： 2 ug （如0.5ug/ul， 即用4ul）
2M CaCl2： 16.5ul
2XHBS： 125ul
按上述順序，往eppendorf管中依次加入上述四種試劑。
先將前三者混勻， zui后加2XHBS。
一種方法是，加2XHBS時(shí)要逐滴加入， 吹打至微現(xiàn)乳白色， 立即均勻滴入培養(yǎng)皿，輕輕搖勻后置于培養(yǎng)箱中，6-8h后換液。
另一種方法是， 加入2XHBS后立即吹打約40下（不過這個(gè)要根據(jù)每個(gè)人的力道和吹打的頻率而定， 建議做一個(gè)梯度實(shí)驗(yàn)，吹打不同的次數(shù)看哪次的轉(zhuǎn)染效率高以后就按這個(gè)次數(shù)來吹打）， 之后步驟同上， 立即均勻滴入培養(yǎng)皿，輕輕搖勻后置于培養(yǎng)箱中，6-8h后換液。
磷酸鈣法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞
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